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  Molekularbiologische Charakterisierung des proliferations-assoziierten Ki-67 Proteins (pKi-67)
M. Duchrow¹, C. Schlüter² und J. Gerdes³
Klinik für Chirurgie des Universitätsklinikums Schleswigholstein, Campus Lübeck¹ , Campus Kiel² und Forschungszentrum Borstel³

Einleitung

Für die Tumorforschung ist die Untersuchung der Proliferation (Zellteilung) somatischer Zellen von elementarem Interesse. Zum einen liegt in der unkontrollierten Zellteilung einer der Schlüssel für die Tumorentstehung, zum anderen wird in der Routinediagnostik die quantitative Erfassung der Zellproliferation benötigt um das biologische Verhalten von Neoplasien zu prognostizieren. Für die Funktion vielzelliger Organismen ist daher die Kontrolle bzw. Unterdrückung des Teilungspotentials der Zellen von entscheidender Bedeutung.

Die Aggressivität eines Tumors korreliert oft mit der Zellteilungsrate der entarteten Zellen. In der "klassischen" histopathologischen Tumordiagnose werden die Zellteilungsraten anhand der sich in Mitose befindlichen Zellen bestimmt. Da diese Bestimmung jedoch sehr zeitaufwendig ist, wurde nach einfach einzusetzenden "Proliferationsmarkern" gesucht. Einen solchen Marker stellt der monoklonale Antikörper Ki-67 dar. Antikörper werden heute routinemäßig für verschiedenste spezifische Gewebeanfärbungen eingesetzt. Ki-67 wurde ursprünglich während der Herstellung von spezifischen Markern für Hodgin- und Reed-Sternberg Zellen isoliert (Gerdes et al. 1983) und reagiert mit einem Antigen, das nur in den Kernen proliferierender Zellen (G₁-, S-, G₂-Phase und Mitose) exprimiert wird. In ruhenden Zellen (G₀-Phase) wird das Antigen nicht (Gerdes et al. 1984, Schrape, Jones & Wright 1987, Braun, Papadopoulos & Müller-Hermelink 1988, Tazzari et al. 1990, Bruno & Darzynkiewicz 1992).

Am Beispiel von peripheren Lymphozyten, die mit dem Lektin Phytohaemagglutinin A (PHA) stimuliert wurden, konnte gezeigt werden, dass die Expression des Ki-67 Antigens 24 bis 36 h nach der Aktivierung der Zellen mit PHA nachweisbar ist (Abb. 1). Weiterhin konnte in einem experimentellen "Tumor Xenograft Modell" gezeigt werden, dass der Index, der mit monoklonalen Antikörpern gegen das Ki-67 Antigen bestimmt wurde, exakt mit der Wachstumsfraktion korreliert (McCormick et al. 1993). In der histopathologischen Routine-Diagnostik ist es daher möglich, mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern gegen das Ki-67 Antigen sowie mit immuncytochemischen Methoden schnell und reproduzierbar die Wachstumsfraktion einer humanen Zell-Population zu bestimmen (Brown & Gatter 1990, Gerdes 1990).

Zahlreiche retrospektive Studien zeigten, dass die Determinierung der Wachstumsfraktion mit Ki-67 tatsächlich ein unabhängiger prognostischer Marker ist (Gerdes et al. 1987, Grogan et al. 1988, Hall et al. 1988, Bouzubar et al. 1989, Holte et al 1989, Nicholson et al. 1991, Tungekar et al. 1991, Wintzer et al. 1991, Fontana et al. 1992, Locker et al. 1992). In allen Tumorklassen, die bis jetzt untersucht wurden, besteht eine hochsignifikante Korrelation zwischen den Mittelwerten des Ki-67 Index und der histopathologischen Malignitätseinschätzung, wobei jedoch die individuellen Werte innerhalb der histopathologisch definierten Tumorstadien stark variieren. Aus diesem Grund sollte die Bestimmung der Tumor-Wachstumsfraktion mit Ki-67 eine objektive Hilfe zur Beurteilung eines Tumorfalls und von besonderer Bedeutung für die Auswahl einer individuellen Tumortherapie sein.

Obwohl der monoklonale Antikörper Ki-67 bereits 1983 isoliert wurde und seine Bedeutung in der histopathologischen Tumor-Einordnung bekannt war, konnte man ein Jahrzehnt lang nur sehr wenig über das Ki-67 Antigen ("Ki-67 Protein") in Erfahrung bringen. Das Ki-67 Protein konnte bis heute weder angereichert noch biochemisch genau charakterisiert werden. Es wird allgemein als nicht-Histon Kern-Protein beschrieben, das durch Proteasen sehr schnell abgebaut wird (Gerdes et al. 1983; Gerdes, 1990).

Immun-Klonierung und Immun-Blot des Ki-67 Proteins

Um mehr über das Ki-67 Protein in Erfahrung zu bringen, entschlossen wir uns, das Gen des Ki-67 Proteins zunächst zu klonieren und zu sequenzieren. Wir begannen die Klonierung des Ki-67 Protein-Gens, indem wir eine Lamda gt11 Expressions-Bibliothek aus cDNA der Zellinie IM9 ausplattiert und mit dem mAK Ki-67 gefärbt haben ("Immunoscreening"). Von insgesamt 2 x 10⁶ Plaques konnten schließlich 10 unabhängige positive Klone isoliert werden. Eine Sequenz-Analyse zeigte, dass acht der Klone identisch waren. Wir stellten fest, dass die Insertionen aller Klone repetitive Elemente von ca. 366 bp Länge enthielten, die wir "Ki-67 Repetitionen" nannten. Wiederum jede dieser Repetitionen enthält ein hochkonserviertes 66 bp langes "Ki-67-Motiv". Die resultierenden drei cDNA-Sequenzen zeigten keine signifikanten Homologien mit den in den Gen-Datenbanken "EMBL" und "GenBank" gespeicherten Sequenzen.

Nach der Umklonierung eines 1092 bp großen Fragments in geeignete Expressions-Vektoren konnte, wie es zu erwarten war, anhand von "Immun-Blots" demonstriert werden, dass die im richtigen Leseraster klonierten und in E. coli exprimierten Fragmente mit dem mAK Ki-67 reagierten. Weiterhin ergaben Northern Blot Analysen, dass das 1092 bp Fragment mit großen mRNA-Molekülen aus proliferierenden Zellen hybridisierte, nicht jedoch mit mRNA-Molekülen aus G₀-Phase Zellen (Gerdes et al. 1991). Mit Hilfe des gleichen cDNA-Fragments als Hybrididierungsprobe konnte das Gen schließlich auf dem langen Arm des Chromosoms 10 lokalisiert werden (10q25-ter; Fonatsch et al. 1991).

Etwa zur gleichen Zeit gelang es unserer Mitarbeiterin Li Li erstmals das native Ki-67 Protein über eine schnelle Protein-Präparationsmethode im Immun-Blot von Lysaten proliferierender Zellen als Doppel-Bande mit apparenten Molekulargewichten von 345 kD und 395 kD darzustellen (Gerdes et al. 1991). Diese Molekulargewichte korellierten gut mit der im Northern Blot zuvor ermittelten Größe der mRNA überein.

Die vollständige Klonierung und Sequenzierung

Um die vollständige cDNA zu isolieren, wurde das 1092 bp Fragment als Hybridisierungsprobe zum erneuten "Screening" von cDNA-Bibliotheken verwendet. Dadurch konnten wir zwei weitere Klone mit homologen Sequenzen zu den Ki-67 Repetitionen isolieren. Von den insgesamt fünf klonierten Fragmenten mit einer Länge von zusammen über 5000 bp überlappten aber nur zwei, so dass wir zu diesem Zeitpunkt nicht sicher sein konnten, dass die Fragmente ausschließlich zu einer einzigen cDNA gehörten. Mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) gelang es uns dann, die fehlenden Abschnitte zwischen den Klonen zu amplifizieren. Die 5' und 3' Enden der cDNA konnten wir schließlich durch "Anker-Primer PCR-Methoden", z.B. RACE-PCR ("Rapid Amplification of cDNA Ends", Frohmann et al., 1988) isolieren.

Die vollständige cDNA hat eine Länge von 12,5 kb und ist in 15 Exons organisiert (siehe Tab. 1). Überraschenderweise konnten wir eine zweite cDNA mit einer Länge von 11,4 kb isolieren, die sich von der 12,5 kb cDNA durch die Abwesenheit eines vollständigen Exons von 1080 bp Länge (Exon 7) unterscheidet (Abb. 1). Mit Hilfe der RT-PCR konnten wir zeigen, dass beide mRNA-Formen in proliferierenden Zellen exprimiert werden. Die kalkulierten Molekulargewichte der abgeleiteten Peptid-Sequenzen von 329 und 359 kD korrelieren gut mit den zuvor experimentell bestimmten Werten der Doppel-Bande. Die beiden cDNA-Sequenzen sowie die abgeleiteten Peptid-Sequenzen zeigten allerdings keine signifikanten Homologien zu den in Datenbanken (EMBL, GenBank und SwissProt) gespeicherten Sequenzen.

Sequenz-Analysen des Ki-67 Proteins

Die beiden Isoformen der abgeleiteten Ki-67 Peptid-Sequenzen haben kalkulierte Molekulargewichte von 358 761 D und 319 508 D mit errechneten isoelektrischen Punkten von PI=9,87 und PI=9,94. Das Protein sollte daher unter physiologischen Bedingungen stark positiv geladen sein; es enthält einen hohen Gehalt an zufällig verteilten Lysin-Aminosäuren (11,4 %). Der ebenfalls ungewöhnlich hohe Gehalt an zufällig verteilten Prolin-Aminosäuren (8,2 %) lässt vermuten, dass das Protein keine ausgeprägten alphahelikalen Domänen besitzt.

Das 13. Exon, das im Zentrum beider Isoformen liegt, enthält alle 16 aneinandergereihten Ki-67 Repetitionen, die zwischen 42 % und 62 % identische Aminosäuren mit der 122 Aminosäuren langen Konsensussequenz aufweisen (Abb. 1). Die 22 Aminosäuren der hochkonservierten Ki-67 Motive innerhalb dieser Repetitionen sind zu 71 % bis 100 % identisch. Die Repetitionen und Motive des Ki-67 Proteins, die ca. zwei Drittel der gesamten Ki-67 Protein-Sequenz bilden, wurden bislang bei keinem anderen Protein beschrieben, zumal keine signifikanten Homologien zu bekannten Sequenzen gefunden wurden. Obwohl es wahrscheinlich ist, dass die Repetitionen durch Tandem-Duplikationen entstanden sind, lässt sich dafür kein Beweis aus den Sequenzen selbst ableiten.

Auf den beiden Isoformen des Peptids sind insgesamt zehn Kern-Ziel-Erkennungssequenzen ("nuclear targeting sites") verteilt angeordnet, darunter acht so genannte "bipartite nuclear targeting sites", die deutlich zeigen, dass das Ki-67 Protein aktiv in den Zell-Kern transportiert wird. Am C-terminalen Ende der Peptid-Sequenzen wurde eine potentielle ATP/GTP-Bindungsstelle des Motivs A ("P-Loop") identifiziert (siehe Tab. 1), die auf eine mögliche Kinase-Aktivität des Ki-67 Proteins hinweist. Über 200 potentielle Phosphorylierungs-Stellen (143 Phosphokinase C-, 89 Caseinkinase II- und zwei Tyrosinkinase-Stellen), 19 N-Myristoylierungs- und drei Amidierungs-Stellen weisen auf eine vermutlich starke posttranslationale Modifizierung des Proteins hin. 10 starke und 40 schwache sog. P-E-S-T Sequenzen (Peptidsequenzen mit den Aminosäuren Prolin (P), Glutamin (E), Serin (S) und Threonin(T)), die als potentielle Protease-Erkennungssequenzen dienen (Rogers et al., 1986; siehe Tab 1 und Abb. 1), könnten eine Erklärung für die relativ kurze biologische Halbwertszeit und Labilität des Ki-67 Proteins bieten. Die stark konservierte Cystein-Aminosäure an der Position 8 der Konsensussequenz (Abb. 1) könnte auf mögliche Disulfid-Brückenbildungen hindeuten, die aber wegen der reduzierenden Bedingungen im Zell-Kern als unwahrscheinlich gelten.

Das konservierte Ki-67 Motiv

Wie bereits erwähnt, codiert das zentrale Exon 13 für 16 aneinander gereihte Ki-67 Repetitionen von ca. 122 Aminosäuren Länge, die jeweils ein stark konserviertes, 22 Aminosäuren langes Ki-67 Motiv enthalten. Das Ki-67 Motiv ist offensichtlich stark immun-dominant, da es die Epitope des originalen mAK Ki-67, verschiedener Ki-67 äquivalenter mAK (Key et al., 1992) sowie einer Reihe neuer mAK (MIB 1, MIB 2 und MIB 5; Key et al., 1993; Becker et al., 1993) enthält, die durch Immunisierung mit dem rekombinant exprimierten 1092 bp Fragment (s.o.) hergestellt wurden. Da das Ki-67 Antigen auch in anderen Spezies als homo sapiens mit Antikörpern gegen das Ki-67 Motiv nachgewiesen wurde (Falini et al, 1989), ist das Ki-67 Motiv wahrscheinlich eine wichtige Struktur zur Einleitung oder Aufrechterhaltung der Mitose in eukaryotischen Zellen.

Computer-Vorhersagen der dreidimensionalen Struktur des Ki-67 Motivs, die mit verschiedenen Programmen durchgeführt wurden, ergaben immer eine Alphahelix (Schlüter et al., 1993). Die 16 Alphahelices der Ki-67 Motive haben eine typisch amphophile Struktur wie die Anordnung der geladenen und ungeladenen Aminosäuren zeigt:

TPKEKAQALEDLAGFKELFQTP (geladene Aminosäuren unterstrichen).

Man kann daher vermuten, dass das Ki-67 Protein über dieses Motiv mit anderen Makromolekülen oder Membranstrukturen in Wechselwirkung tritt.

Die absolute Notwendigkeit für den Zell-Zyklus

Die Abhängigkeit des Zell-Zyklus von der Expression des Ki-67 Proteins wurde von unserem Mitarbeiter Michael Kubbutat mit Hilfe der ³H-Thymidin Inkorporation in Zellen untersucht, die zuvor mit Sense- bzw. Antisense-Oligonukleotiden (0,5 bis 20 µM) inkubiert wurden. Die Oligonukleotide waren spezifisch für die ersten 20 codierenden Basen der Ki-67 Protein-mRNA. Die ³H-Thymidin Inkorporation wurde Dosis-abhängig von Antisense- nicht aber von Sense-Oligonukleotiden herabgesetzt (Schlüter et al., 1993). Aus diesem Ergebnis kann geschlossen werden, dass die Expression des Ki-67 Proteins eine wichtige Voraussetzung oder sogar absolute Notwendigkeit für die Aufrechterhaltung des Zell-Zyklus ist.

Zusammenfassung, Perspektiven und mögliche Funktionen des
Ki-67 Proteins

Das Ki-67 Protein kann als Protease-sensibles alkalisches Zell-Kern Protein mit repetitiven Elementen und einem hohen Gehalt an zufällig verteilten Prolin- (8,2 %) und Lysin-Aminosäuren (11,4 %) beschrieben werden, das in zwei unterschiedlich großen Isoformen auftritt und das wahrscheinlich posttranslational modifiziert wird. Das Ki-67 Protein ist für die Aufrechterhaltung des Zell-Zyklus wahrscheinlich absolut erforderlich. Jede der 16 Ki-67 Repetitionen enthält ein konserviertes Ki-67 Motiv mit einem amphopilen und wahrscheinlich immundominanten Charakter. Erwähnenswert sind hunderte von potentiellen Phosphorylierungs- und anderen posttranslationalen Modifikations-Stellen sowie eine ATP/GTP Bindungsstelle am C-terminalen Ende. Das Ki-67 Protein akkumuliert von der G₁-Phase zur Mitose, in der es seine maximale Konzentration in der Zelle erreicht. Unmittelbar nach Abschluss der Mitose erreicht das Ki-67 Protein sein Minimum, während es in ruhenden Zellen nicht nachweisbar ist. Die relativ kurze biologische Halbwertszeit des Proteins kann mit seiner hohen Protease-Sensibilität erklärt werden. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass das Protein in jedem Zell-Zyklus de novo synthetisiert wird, ohne die Möglichkeit posttranskriptionaler oder posttranslationaler Regulation außer Betracht zu lassen.

Da das Ki-67 Protein einen hohen Überschuss an positiv geladenen Aminosäuren aufweist, kann man eine Nukleinsäure-bindende Eigenschaft postulieren. Damit könnte man die beobachtete starke Anfärbung der Nukleoli während der G₁-Phase erklären, die auf rein elektrostatischer Anziehung des Ki-67 Proteins durch de novo synthetisierte, negativ geladene rRNA beruhen könnte. Ein Two-Hybrid-Screening ergab, dass der mittlere Teil von pKi-67 an viele Proteine des Nukleolus binden (siehe "Neue Ergebnisse: Zusammenfassung meiner kumulativen Habilitationsschrift"). Nach der Auflösung der Kernhülle ist das Ki-67 Protein überwiegend auf den Chromosomen lokalisiert. Auch die Bindung an die Chromosomen könnte auf der elektrostatischen Anziehung des Ki-67 Proteins durch die negativ geladene DNA beruhen. Es ist daher nicht auszuschließen, dass das Ki-67 Protein eine Art Matrix der chromosomalen DNA bildet oder sogar zur Kondensation der Chromosomen beiträgt.

Weitere Untersuchungen werden zeigen, welche Rolle die beiden Isoformen der Ki-67 Proteine im Zell-Zyklus spielen. Die Aufklärung der primären Struktur des Proteins hat gezeigt, dass es sich um ein bisher beispielloses, einzigartiges Protein handelt.

Struktur der human Ki-67 Protein cDNA.

Die beiden horizontalen Linien entsprechen den mRNAs der Ki-67 Protein Lang- und Kurz-Form in Transkriptionsrichtung vom 5'Ende zum 3'Ende. Die Positionen der Introns sind durch vertikale Linien gekennzeichnet. Die Positionen der 16 homologen Ki-67 Repetitionen des 13. Exons (6845 bp) werden durch gefüllte Rechtecke angedeutet. Die Lang-Form des Ki-67 Protein mRNA enthält das Exon 7 (1080 bp), während der Kurz-Form Exon 7 fehlt. Die Positionen des Stopp-Codons und der vier potentiellen Polyadenylierungs-Sequenzen wurden gekennzeichnet. Das erste Start-Codon (ATG) befindet sich in Exon 2. Die 10 starken P-E-S-T Sequenzen (Peptidsequenzen mit den Aminosäuren Prolin (P), Glutamin (E), Serin (S) und Threonin(T)) sind durch gefüllte Kreise gekennzeichnet. Die Aminosäure Konsensussequenz der 16 Ki-67 Repetitionen wurde im unteren Teil der Abbildung wiedergegeben (int. ein-Buchstaben-Kode). Sternchen deuten auf Aminosäure-Positionen mit weniger als 8 identischen Aminosäuren (Homologie-Grad < 50 %) hin, während besonders stark konservierte Aminosäuren in Kästchen eingerahmt sind. 

Tab. 1: Die Exons der Ki-67 mRNA: Zusammenfassung der Eigenschaften und Homologien

Danksagung

Vielen Dank an die Dr. Mildred Scheel Stiftung für Krebsforschung, die diese Arbeit (durchgefürt am Forschungsinstitut Borstel) im Rahmen des Projektes W 23/93/Ge 3 großzügig unterstützte. Mein besonderer Dank gilt Frau Claudia Wohlenberg für ihre hervorragende Assistenz bei der Klonierung und Sequenzierung.

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Abrufe seit dem 28.11.2001: Zuletzt aktualisiert am 10.März 2005