Die Ki-67
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Nukeolus, schematische Darstellung (hellblau=rRNA, rot=pKi-67)
(modifiziert nach Kill et al., 1996)
Neue Ergebnisse:
Klonierung,
Charakterisierung und Funktionsanalyse des proliferationsassoziierten
Ki-67
Antigens
Zusammenfassung der kumulativen Habilitationsschrift
(Universität zu Lübeck, Medizinische Fakultät, 2003)
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PDF Datei Einleitung
Das humane Antigen pKi-67 ist durch den monoklonalen Antikörper Ki‑67 definiert und wird ausschließlich in proliferierenden Zellen exprimiert. Untersuchungen zur Lokalisation von pKi‑67 ergaben, dass es sich während der Interphase (aktive Phasen der Zellteilung mit Ausnahme der Kernteilungsphase) hauptsächlich in den Kernkörperchen (Nukleoli; Orte der rRNA-Transkription) befindet. Während der Kernteilungsphase (Mitose) ist pKi-67 dagegen auf der Oberfläche der kondensierten Chromosomen nachweisbar.
Ergebnisse
Die Klonierung und Sequenzierung der cDNA von pKi-67 ergab, dass es sich um ein Protease-sensibles, alkalisches Zell-Kern Protein mit repetitiven Elementen (sechzehn homologe „Ki‑67 Tandem-Repetitionen“ von je ca. 122 Aminosäuren) und einem hohen Gehalt an zufällig verteilten Prolin- und Lysin-Aminosäuren handelt, das in zwei unterschiedlich großen Isoformen (345 kD bzw. 395 kD) auftritt und das wahrscheinlich posttranslational modifiziert wird, insbesondere durch Phosphorylierung. Als molekulare Ursache der unterschiedlich großen Isoformen wurde das alternative Spleißen des 1080 bp großen Exon 7 festgestellt. Jede der sechzehn Ki‑67 Tandem-Repetitionen, die von Exon 13 kodiert werden, enthält ein hochkonserviertes „Ki‑67 Motiv“ mit einem amphophilen und wahrscheinlich immundominanten Charakter.Antisense-Inhibitionsversuche ergaben, dass pKi-67 für die Aufrechterhaltung des Zellzyklus wahrscheinlich absolut erforderlich ist. Mittels Untersuchungen zur Expression des pKi-67 Gens wurde festgestellt, dass pKi‑67 ausschließlich über die de novo Transkription (Neusynthese) bzw. die Degradation über den Ubiquitin- und Proteasom-abhängigen Abbauweg kurzlebiger Proteine reguliert wird. Bei Auftreten eines Zellzyklus-Arrests kann die Halbwertzeit des Proteins aber erheblich ausgedehnt sein. Anhand des Vergleichs der mRNA und Proteinexpression in kolorektalen Tumoren konnten posttranskriptionelle Regulationsmechanismen von pKi-67 praktisch ausgeschlossen werden.
Über ein 2-Hybrid-Klonierungs-System
wurden
zahlreiche Interaktionspartner von pKi‑67 identifiziert.
Demzufolge
interagiert pKi-67 vor allem mit Proteinen des Nukleolus sowie
verschiedenen
DNA- sowie Zellzyklus-assoziierten Proteinen. Die festgestellte
Interaktion
des C-Terminus von pKi-67 mit den Heterochromatin-bindenden
Proteinen HP1Hs a
und b
wurde mehrfach durch andere Arbeitsgruppen bestätigt. Die
identifizierte Bindung
von pKi-67 an Importin 7 (RanBP7) könnte die Lokalisation von
Cyclinen oder
Cyclin-abhängigen Kinasen (cdk) beeinflussen. Weitere Versuche
ergaben, dass die Expression rekombinanter
Fragmente aus Exon 7 und 13
von pKi-67 im Zellkern selektiv die
Translokalisation von Cyclin B zum
Nukleolus verursachte. Cyclin B bildet mit
cdk1 („cyclin dependent kinase 1“;
p34cdc2) am Ende der Interphase
einen aktiven Komplex, den „Maturation Promoting Factor“ (MPF),
der
wahrscheinlich alle Ereignisse initiiert, die eine
Interphasezelle zur Mitose
führen.
Diskussion
Aus diesen sowie weiteren Erkenntnissen aus Versuchen zur Expression rekombinanter Teilstrukturen konnten für pKi-67 folgende, nach Domänen aufgeteilte Funktionen vorgeschlagen werden:Die N-terminale Domäne, die in der mRNA Exon 1 bis 12 umfasst, reguliert die Interaktionsfähigkeit von pKi-67 und befähigt das Protein zur Selbstassoziation und Polymerisation.
Der mittlere Bereich, der 16 Tandem-Repetitionen aus Exon 13 enthält, vermittelt eine Vielzahl von Bindungen, die es dem Protein ermöglichen, als „Carrier“ zu funktionieren und die der Grund für die Assoziation mit den Nukleoli sind. Wahrscheinlich dirigieren die Tandem-Repetitionen Cyclin B und damit den MPF selektiv in die Nukleoli und initiieren damit die massive Phosphorylierung der nukleolären Proteine einschließlich pKi-67.
Der C-Terminus,
der in der mRNA
das Ende von Exon 13 sowie die Exons 14 und 15 umfasst, bedingt die
Affinität
zu Heterochromatin. Dadurch trägt der C-Terminus in der
frühen G1-Phase
des Zellzyklus zur Verankerung der Chromosomen an der Innenseite
der Kernmembran
bei. Diese Funktionen finden jedoch nicht beliebig auf allen
Chromosomen
statt, sondern nur im Bereich der Nukleoli bzw. der
„Nukleolären Organisations
Regionen“ (NOR).
Den Ergebnissen
der in der Habilitationsschrift zusammengefassten Original-Artikel
zufolge ist die wichtigste Funktion von pKi-67 die Regulation
der Desintegration und Reformation der Nukleoli. Im Rahmen dieser
Funktion induziert bzw. unterstützt es ebenfalls teilweise
die Kondensation und Dekondensation der
Chromosomen. Die Expression, Phosphorylierung,
Dephosphorylierung sowie Degradation von pKi-67 folgt dabei
einem Zyklus, der parallel zum Zellzyklus verläuft.